凝胶型胶原敷料修复糖尿病皮肤缺损及促进血管再生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.017

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (52): 8456-8462.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.017

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凝胶型胶原敷料修复糖尿病皮肤缺损及促进血管再生

雷静^1，2，3，刘旭昭^2，3，陈淡嫦^2，3，张永斌⁴，汤顺清^1，3

¹暨南大学生物医学工程研究所，广东省广州市 510632；²广州创尔生物技术股份有限公司，广东省广州市 510663；³广东省医用胶原工程技术研究开发中心，广东省广州市 510663；⁴广州中医药大学实验动物中心，广东省广州市 510405

修回日期:2014-12-01 出版日期:2014-12-17 发布日期:2014-12-17
通讯作者: 汤顺清，教授，博士生导师，暨南大学生物医学工程研究所，广东省广州市 510632
作者简介:雷静，女，1980年生，湖北省襄阳市人，汉族，暨南大学在读博士，主要从事生物医用材料与皮肤组织修复方面的研究。
基金资助:
广东省海洋经济创新发展区域示范专项(GD2012-B03-002)；广东省科技计划项目(2012B070800007)；科技型中小企业创新基金(11C26214413212)；广州市科技计划项目(2014JR000021)

Collagen gel dressings repair diabetic skin defects and promote angiogenesis

Lei Jing^{1, 2, 3}, Liu Xu-zhao^{2, 3}, Chen Dan-chang^{2, 3}, Zhang Yong-bin⁴, Tang Shun-qing^{1, 3}

¹Institute of Biomedical Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; ²Guangzhou Trauer Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou 510663, Guangdong Province, China; ³Guangdong Medical Collagen Engineering Technology Research and Development Center, Guangzhou 510663, Guangdong Province, China; ⁴Laboratory Animal Center, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Revised:2014-12-01 Online:2014-12-17 Published:2014-12-17
Contact: Tang Shun-qing, Professor, Doctoral supervisor, Institute of Biomedical Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Guangdong Medical Collagen Engineering Technology Research and Development Center, Guangzhou 510663, Guangdong Province, China
About author:Lei Jing, Studying for doctorate, Institute of Biomedical Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Guangzhou Trauer Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou 510663, Guangdong Province, China; Guangdong Medical Collagen Engineering Technology Research and Development Center, Guangzhou 510663, Guangdong Province, China
Supported by:
the Special Fund for the Innovative and Developmental Region of Marine Economy in Guangdong Province, No. GD2012-B03-002; the Science and Technology Plan of Guangdong Province, No. 2012B070800007; the Innovation Fund for Small- and Medium-Sized Enterprises of Science and Technology Based Firms, No. 11C26214413212; the Science and Technology Plan of Guangzhou City, No. 2014JR000021

摘要/Abstract

摘要：

背景：胶原已经被证实能够促进受损组织创面的修复，加速创面愈合。

目的：观察凝胶型活性胶原敷料对糖尿病皮肤缺损愈合的影响，以及在促进毛细血管再生方面的作用。

方法：取SD大鼠160只，其中40只为正常对照，另120只腹腔注射链脲佐菌素制作糖尿病模型。造模9周后将120只大鼠随机均分为模型组、阳性对照组、实验组，连同正常对照组在大鼠背部制作全层皮肤缺损创面，正常对照组和模型组创面外敷灭菌凡士林，实验组外敷凝胶型胶原敷料，阳性对照组外敷重组人表皮生长因子凝胶，观察各组创面愈合面积及毛细血管新生情况。

结果与结论：给药第1周，除正常对照组动物愈合较快外，其余各组动物创面愈合速度差异不大；给药第2周，正常对照组愈合速度最快，阳性对照组、实验组创面未愈合面积小于模型组；给药第3周，正常对照组及实验组创面未愈合面积小于模型组和阳性对照组；给药第4周，正常对照组及阳性对照组未愈合面积小于模型组和实验组；并且实验组给药第2，3周的创面愈合效果好于阳性对照组。实验组给药第1，2，3周的毛细血管数均多于其余3组。结果表明凝胶型胶原敷料可促进糖尿病缺损创面愈合速度并提高愈合质量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 胶原, 凝胶, 胶原敷料, 糖尿病大鼠, 皮肤缺损, 血管再生, 重组人表皮生长因子

Abstract:

BACKGROUND: Collagen has been shown to promote the restoration of damaged tissue wound and to accelerate wound healing.

OBJECTIVE: To observe the effect of collagen gel dressing on defect healing of diabetic skin and its role to promote capillary regeneration.

METHODS: Forty of 160 Sprague-Dawley rats were used as normal controls, and the other 120 rats were used to make diabetic models with intraperitoneal injection of streptozotocin. After 9 weeks, 120 model rats were randomly divided into model group, positive control group and experimental group. Then full-thickness skin wounds were made on the back of all rats. The normal group and model group were externally treated with vaseline. Experimental group was externally treated with collagen gel dressing, and recombinant human epidermal growth factor gel was used in the positive control group. Finally, the healing area of wounds and newborn capillaries were observed.

RESULTS AND CONCLUSION: At 1 week of administration, animals in the normal control group showed faster wound healing, but the wound healing rates in the other groups were changed insignificantly; at 2 weeks of administration, the healing rate of the normal control group was fastest, and the nonhealing area in the model group was larger than that in the positive control and experimental groups; at 3 weeks of administration, the nonhealing area of the normal control and experimental groups was smaller than that of the model and positive control groups; at 4 weeks of administration, the nonhealing area of the normal control and positive control groups was smaller than that of the model and experimental groups. In addition, wound healing was better in the experimental group than the positive control group at 2 and 3 weeks of administration; while the number of capillaries in the experimental group was more than that of the other three groups at 1, 2, 3 weeks of administration. These results suggest that collagen gel dressings can promote healing of diabetic wounds and improve healing quality.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: collagen, gels, bandages, hydrocolloid, diabetes mellitus

中图分类号:

R318

雷静，刘旭昭，陈淡嫦，张永斌，汤顺清. 凝胶型胶原敷料修复糖尿病皮肤缺损及促进血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(52): 8456-8462.

Lei Jing, Liu Xu-zhao, Chen Dan-chang, Zhang Yong-bin, Tang Shun-qing. Collagen gel dressings repair diabetic skin defects and promote angiogenesis [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(52): 8456-8462.

图/表（结果） 2

2.1 各组大鼠造模后日常观察结果 造模成功后的各组实验动物因糖尿病建模或麻醉手术均有不同数量的死亡，进入结果分析的实验大鼠数量为：正常对照组32只、模型组30只、阳性对照组24只、实验组25只。

除正常对照组外，其余各组大鼠实验期间均保持高血糖状态及出现“多饮、多尿、多食、消瘦”症状，符合糖尿病动物模型症状，与正常对照组比较差异极显著，说明糖尿病模型制作成功且稳定。各组大鼠创面手术后的血糖及体质量变化详见表1，2。

2.2 各组大鼠缺损皮肤修复大体观察 术后创面不规则、干燥、红润、分泌物少、创缘凸起，大部分3 d后结痂变硬。各组创面术1周内肉眼观察差异不大，术后第2周起正常对照组、实验组和阳性对照组创面干燥、红润，创缘呈长方形为主，收缩明显，其中正常对照组愈合速度较快(图1)。

2.3 各组大鼠缺损皮肤修复面积 由表3可见，给药第1周，除正常对照组创面愈合较快外，其余各组创面愈合速度差异不大；给药第2周，正常对照组愈合速度最快，说明正常对照组免疫功能未被破坏，阳性对照组、实验组创面未愈合面积小于模型组(P < 0.05)；给药第3周，正常对照组、实验组创面未愈合面积小于模型组和阳性组，且与模型组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；给药第4周，正常对照组及阳性对照组未愈合面积小于模型组和实验组，且与模型组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，实验组愈合速度反而有下降的趋势，但与模型组比较差异无显著性意义。

从愈合率角度分析，实验组与阳性对照组在给药4周的观察周期内治疗效果相当，其中在给药第二三周，实验组对创面愈合的促进作用明显优于阳性对照组(表4)。

2.4 各组大鼠缺损皮肤修复组织学观察结果 见图2。

正常对照组：1周时可见疏松肉芽组织；2周时可见创面坏死组织，其下有较厚肉芽组织及大量中性粒细胞浸润；3周时可见修复的表皮下肉芽开始玻璃样变；4周时可见修复表皮出现皮肤附件。

模型组：1周时可见创面痂形成，其下肉芽层致密并伴大量炎细胞浸润；2周时可见疏松肉芽并伴大量炎细胞浸润；3周时可见痂下肉芽疏松，血管丰富，有大量炎细胞浸润；4周时可见痂下大量中性粒细胞及渗液。

实验组：1周时可见创面及其下疏松肉芽组织，大量中性粒细胞、单核细胞浸润；2周时可见致密肉芽伴大量炎细胞浸润，血管丰富；3周时可见肉芽组织致密，血管丰富，散在单核细胞浸润；4周时可见痂形成及表皮修复，其下疏松肉芽组织。

阳性对照组：1周时可见肉芽组织疏松，大量炎细胞浸润；2周时可见坏死层下疏松肉芽组织伴大量炎细胞浸润；3周时可见修复表皮下肉芽组织开始玻变；4周时可见修复的表皮下肉芽玻变明显，散在炎细胞浸润。

2.5 各组成纤维细胞数水平 实验组成纤维细胞数在第1周时明显多于其他组，成纤维细胞生长能力快于阳性对照组，与模型组比较差异有显著性意义；第2，3，4周成纤维细胞生长比较平稳，表明凝胶型胶原敷料能够通过促进成纤维细胞的增殖，促进糖尿病缺损创面的修复。阳性对照组第1周时成纤维细胞生长慢，同模型组比较差显无显著性意义，第2，3，4周后生成慢慢加快。模型组修复不稳定，比实验组慢。由此可见凝胶型胶原敷料对糖尿病引起的缺损创面具有一定的促进作用，见表5。

2.6 各组大鼠血管新生情况 实验组在新生毛细血管方面，第1周生长速度快于其他组，同模型组比较差异有显著性意义，新生毛细血管前3次取材中都比阳性对照组多，可见实验组凝胶型胶原敷料在促进新生毛细血管的生长方面要比阳性对照组快，见表6。

实验中发现：造模成功后在给药后的4周时间内，模型组皮肤修复程度都是最差的；给药3周时，实验组治疗效果明显优于阳性对照组；至给药4周时，阳性对照组治疗效果明显好转，结果与实验组相似。总体评估，正常对照组、实验组与阳性对照组修复程度相似，且明显优于模型组。

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引言

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，后期可能导致各种组织功能障碍，随着病情进展，糖尿病患者可出现溃疡、缺损等多种皮肤病变。皮肤创伤修复是由组织、细胞、细胞外基质、细胞因子等参与的高度有序的生物学过程，包括炎症反应、组织细胞增殖、肉芽组织形成、再上皮化和组织重塑等^[1]。上述过程都需要良好的细胞微环境，任何影响这些过程和环境的因素都会影响创面愈合。糖尿病患者微循环障碍，这可能是糖尿病皮肤创面难愈或延迟愈合的重要原因之一。根据糖尿病的发病机制，微循环障碍可能与以下因素有关：长期高血糖的慢性毒性逐渐造成各种代谢紊乱，机体内非酶促糖基化反应明显加速，使得晚期糖基化终末产物大量蓄积^[2-3]，局部过量的糖基化终末产物不仅改变了胶原、糖蛋白和蛋白聚糖等细胞外基质的相互作用，还干扰成纤维细胞、内皮细胞的增殖、分化与趋化，致使创面组织细胞代谢异常，引起组织免疫微循环障碍^[4]；在糖尿病病理条件下，皮肤创面血管内皮损伤、血管重构受抑、血管化低下、创面血供不足、局部组织出现闭塞，使新生血管化微循环发生障碍。

近年来，生长因子研究迅速发展，现已证实多种生长因子如表皮细胞生长因子^[5-6]、成纤维细胞生长因子^[7-8]、血小板源生长因子^[9-10]、血管内皮生长因子^[11]、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等均可明显改善糖尿病创面愈合受阻状况^[12]。研究证实，重组人表皮生长因子对细胞具有很强的促分裂作用，能够促进成纤维细胞的分化、增殖及向创面迁移，提供组织再生与修复的基础^[13]，同时刺激内皮细胞分裂，促进上皮细胞再生和保持肉芽组织湿润，加速创面愈合速度，缩短创面愈合时间^[14]；通过作用于细胞生长调节基因，刺激胶原等细胞外基质合成，完成组织构建，调整蛋白质的合成与代谢，改善创面微循环和组织营养，促进组织更新及创伤愈合^[15]；还可促进血管形成及再生，改善局部血循环不足状态，对慢性溃疡创面疗效显著^[16]。表皮细胞生长因子在糖尿病皮肤病变中的积极作用，使其在临床被广泛应用于糖尿病皮肤缺损的治疗^[17]。

胶原作为皮肤组织的关键和主要成分之一，在维持皮肤屏障、组织上皮化等过程中起到重要作用。动物胶原作为皮肤修复材料已被广泛应用于临床治疗皮肤组织缺损^[18-24]，如液体敷料、脱细胞基质敷料、冻干型海绵烧伤敷料、胶原-壳聚糖多孔支架等。本实验拟采用动物源胶原为主要成分的凝胶型胶原敷料治疗糖尿病大鼠背部全层皮肤缺损，与现行临床使用的重组表皮生长因子疗效进行对比，以验证其作为临床治疗糖尿病皮肤缺损修复敷料的可行性及优势。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年4至7月在广州中医药大学实验动物中心完成，实验室防护水平为BSL-2级，为中央与地方共建高校优势学科实验室。

材料：

实验动物：SPF级雄性SD大鼠160只，体质量200-220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证编号：0104936，动物设施使用证明编号0062306。实验动物喂养委托给广州中医药大学实验动物中心SPF级实验室。

实验方法：

糖尿病大鼠模型的制作^[25-27]：将链脲佐菌素用 0.1 mol/L、pH=4.2的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液配制成10 g/L的溶液，现用现配。取SD大鼠120只，禁食12 h后(自由饮水)，一次性腹腔注射55 mg/kg链脲佐菌素。链脲佐菌素注射72 h后监测随机血糖，共观察4周。当血糖值≥ 16.8 mmol/L且持续3周以上维持在此高血糖水平，并有多饮、多尿、多食时，判断为建模成功并入选为糖尿病动物模型。糖尿病模型成立后，连续2次随机血糖值< 16.8 mmol/L，视为血糖恢复。另取40只SD大鼠作为正常对照组，不作相关处理。将造模成功后的糖尿病大鼠随机均分为模型组、实验组、阳性对照组。

糖尿病造模后皮肤缺损模型的制作及分组干预：造模后第9周，将所有大鼠(含正常对照组)用10%水合氯醛 2.5 mL/kg腹腔注射麻醉^[28^]，背部脱毛，常规消毒，无菌条件下背部制作1个3 cm×3 cm的全层皮肤缺损创面，深度达到皮下、筋膜，见受损组织渗漏组织液为准，止血后无菌处理。正常对照组与模型组缺损创面外敷灭菌凡士林0.1 mL/cm²，1次/d；实验组缺损创面外敷凝胶型胶原敷料0.1 mL/cm²，1次/d；阳性对照组缺损创面外敷重组人表皮生长因子凝胶0.1 mL/cm²，1次/d。换药时均先用安尔碘清创，再以无菌生理盐水冲洗创面并拭干。

糖尿病大鼠皮肤缺损模型的稳定性：创面手术后每周监测大鼠血糖及质量。术后的糖尿病模型大鼠容易引起死亡，为确保各时期取材统计都有意义，前3周实验每组只取材6只。

大体观察缺损皮肤修复情况，计算修复面积：术后第7，14，21，28天创面拍照并取材，观察大鼠皮肤愈合及感染情况、瘢痕形状及物理特性等。采用透明薄膜称量法计算修复面积。创伤后第7，14，21，28天，分别用透明薄膜覆盖创面，沿创缘画膜，剪膜，置分度值为 0.1 mg的分析天平称取质量并折换成面积，记录各组溃疡面积，计算溃疡创面未愈合面积，计算愈合率。愈合率=(原面积-未修复面积)/原面积×100%。

光镜下观察修复后组织变化及血管新生情况：术后第7，14，21，28天，每组各处死6只动物，取创缘组织及肉芽组织，体积分数10%甲醛固定，常规石腊包埋，切片进行苏木精-伊红染色，后在光学显微镜观察组织形态的变化。每个标本在创面中心及创缘四周选择5个高倍视野，计数肉芽组织中成纤维细胞数及新生毛细血管数，并求其均值。

主要观察指标：①糖尿病模型的稳定性。②各组大鼠皮肤修复速度和愈合面积。③各组大鼠缺损皮肤组织变化及血管新生情况。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件，数据均采用 x(_)表示，进行单因素方差LSD检验分析。±s

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

糖尿病模型的制备方法及模型的稳定性对实验结果的可靠性非常重要。随着对糖尿病研究的深入，现已有多种建立糖尿病大鼠模型的方法，以往采用的高脂高糖饮食建立糖尿病大鼠模型^[29]，造模时间较长，而且影响因素较多。自1963年Rakieten等^[30]发表了利用链脲佐菌素成功诱发大鼠糖尿病模型的文章，现链脲佐菌素已成为广泛采用的糖尿病动物模型化学诱导剂。一次性大剂量链脲佐菌素腹腔或静脉注射可使胰岛β细胞受损引发1型糖尿病，其具有简便、用量小、药物毒性低、对胰岛β细胞损伤特异性强、诱发动物糖尿病模型成功率高且一般不发生自发性缓解等诸多优点^[31-32]。

由于链脲佐菌素的作用与性别有关^[33]，雄性大鼠制备模型成模率明显高于雌性大鼠^[34]，此外，腹腔注射具有操作简便、准确快速的特点，故本实验采用链脲佐菌素雄性大鼠腹腔注射给药的方式。本实验为评估模型的稳定性，在动物实验中增加了正常对照组和模型组，以血糖及体质量为关键考察指标，衡量模型在实验期间的稳定性。结果发现，给药4周后所有符合建模成功标准大鼠的血糖值基本趋于稳定，且长期维持在较高的水平，同时也能观察到大鼠表现出的一些典型糖尿病临床症状，如消瘦、多饮、多尿等。成模后的大鼠与相同时点正常对照组的大鼠血糖值相比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，体质量相比差异均有显著性意义(P <0.01)，表明糖尿病大鼠模型制备成功。在糖尿病大鼠背部制备的全层皮肤缺损创面模型上，观察到的创面炎症细胞浸润、创面愈合时间等明显延迟，也表明了该动物模型与临床糖尿病皮肤缺损患者创面愈合情况相似。此外，比较大鼠的皮肤创面愈合率发现，糖尿病模型组的创面愈合率明显低于正常对照组(P <0.01)，说明糖尿病局部创面的不易愈合性。

胶原是细胞外基质的主要组成物质，能够促进局部微环境的调控，在皮肤修复、伤口愈合及纤维化过程中起重要作用^[35]。已有研究显示胶原对组织损伤的修复是通过本身的填充修复，以及与其他细胞及内源性生长因子的介导作用完成的^[36]。胶原可以促进中性粒细胞、巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞的增殖、分化、迁移，活化的细胞在创面修复中发挥极其重要的作用^[37]。大量增殖的成纤维细胞通过迁移、分化、合成分泌胶原基质，新生胶原基质一方面可以加快细胞外基质的重建，充填组织缺损，为细胞的迁移和增殖提供良好支架，另一方面可与肌成纤维细胞协同作用收缩创面使伤口得到修复。有研究发现，链脲佐菌素诱导的糖尿病裸鼠皮肤创面不易愈合，其皮肤出现真皮层变薄、胶原含量减少、皮肤糖含量增加等组织改变^[38]。已有研究证实，胶原具有良好的生物相容性，可通过促进成纤维细胞增殖促进免疫低下小鼠伤口愈合，具有潜在的临床应用价值^[39]。此外，目前认为创面愈合过程中新生血管的来源主要是结缔组织中小血管和毛细血管以肉芽方式向外生长，或是血管周围细胞增生分化(如成纤维细胞)成内皮细胞而使新生血管生成^[40]。胶原通过活化细胞作用积极地参与此新生血管生成过程。

本实验在局部病损部位提供活性胶原凝胶敷料用于维持皮肤屏障，阻隔外界刺激，提供外源性胶原促进创面修复。结果初步表明，胶原凝胶用于治疗糖尿病病损创面，能明显缩小创面面积，加快创面愈合，经过组织病理学观察，发现凝胶型胶原敷料治疗部位的毛细血管数量相比模型组有较大提升，表明胶原凝胶参与了以加速血管新生为特点的创面愈合过程；相比阳性对照组，二者疗效相当。因此，推断胶原凝胶敷料通过调控细胞微环境修复糖尿病皮肤缺损的机制与重组人表皮生长因子有一定的相似性。

上述研究提示，凝胶型胶原敷料主要通过促进病损部位新生肉芽组织生长和毛细血管再生来加速血管新生，以加快糖尿病皮肤缺损组织愈合速度并提高愈合质量，从而起到创面护理和组织修复的效果。凝胶型胶原敷料中的主要成分为来源牛跟腱的Ⅰ型胶原，其生物相容性好，已经过长期的临床应用^[41-45]。实践证明Ⅰ型胶原敷料安全性高，免疫原性低，具有加速愈合、改善创面瘢痕和色素沉着的功能。研究发现，凝胶剂型较水剂在治疗糖尿病、烧伤等敏感创面、延迟愈合创面时有一定的优势^[46-47]，因此凝胶型胶原敷料治疗糖尿病皮肤创面效果可能更为理想：一是凝胶型胶原敷料可在创面表面形成一层薄膜，可作为皮肤屏障对创面起到一个隔离和保护的作用，防止细菌污染，防止水分与体液从创面蒸发和流失，给缺损组织提供一个利于细胞增殖和血管再生的微环境，诱导皮肤自身细胞的增殖分化、毛细血管新生，缩短组织愈合过程，减少瘢痕增生；二是凝胶剂在创面的停留时间比液体制剂长，对创面细胞起到连续诱导的作用，加速创面愈合；三是凝胶基质对创面有一定的缓解安抚作用，减轻对创面的直接刺激；四是凝胶使创面保持一个湿润愈合的环境，可有效防止创面干燥，避免换药时因敷料粘连创面而造成新的创伤，可在原位反复给药，有效减轻患者疼痛。由此可见，凝胶型胶原敷料作为一种新型生物敷料在治疗包括糖尿病皮肤溃疡烧伤创面等多种创伤组织修复中有广阔的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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凝胶型胶原敷料修复糖尿病皮肤缺损及促进血管再生

Collagen gel dressings repair diabetic skin defects and promote angiogenesis

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